Senger sequencing (enzymatic method)

Секвенирование по Сэнгеру (ферментативный метод) — техника секвенирования однонитчатой ДНК. В основе метода — присоединение (отжиг, см.) к однонитчатой ДНК-мишени секвенирующего праймера (см. Праймер) или обратного секвенирующего праймера (обычно синтетических олигонуклеотидов). Реакционная смесь переносится в 4 пробирки, куда добавляются все 4 дезоксинуклеозидтрифосфата, один из которых мечен по ³²P. Каждая пробирка содержит различные дидезоксинуклеозидтрифосфаты (ддАТФ, ддСТФ, ддГТФ и ддТТФ). Для синтеза комплементарной копии к однонитчатой последовательности-мишени в пробирки добавляется фрагмент Кленова (см. Кленова фрагмент). В результате происходит удлинение праймера в соответствии с матричной последовательностью. Когда в растущую цепь вместо соответствующего дНТФ в матрице включается ддМТФ, 3'-конец растущей цепи теряет гидроксильную группу и не может дальше удлиняться: цепь терминируется. В итоге каждая реакционная смесь получит популяцию радиоактивно меченных фрагментов ДНК с общим 5'-концом (праймер), но с разными 3'-концами. После окончания реакции ДНК денатурируется, подвергается электрофорезу в тонкослойном полиакриламидном геле (см. Секвенирующий гель) и с помощью радиоавтографии выявляются радиоактивные полосы. Последовательность нуклеотидов в исходной ДНК-мишени может затем прочитываться прямо с радиоавтограммы.